【요약서】

【요약】

본 발명은 유효성분으로서 자죽염의 비만 세포를 매개로 하는 즉각형 알레르기질환 조절의 신규한 용도에 관한 것이다.

【명세서】

【발명의 명칭】

자죽염의 비만 세포를 매개로 하는 즉각형 알레르기 질환 조절의 신규한 용도 {Novel usage of purple-bamboo-salt for the regulation of immediate-type allergic  diseases}

【발명의 상세한 설명】

【발명의 목적】

【발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술】

본 발명은 비만 세포를 매개로 하는 즉각형 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

현재 산업의 발달로 인하여 발생되는 환경오염, 새로운 합성 신물질의 증가, 주거환경의 변화 등에 따른 실내외 알레르겐을 포함한 알레르기 유발인자의 증가로 천식 및 알레르기 질환으로 고통 받는 사람들의 수가 점차 증가하고 있는 실정이다.

알레르기 반응 과정 중 발생하는 임상 증상들은, 반응 초기의 특이적 면역반응과 반응 후기의 염증 반응 등이 있다. 전기 알레르기 반응은 거의 대부분 비만세포를 매개로 일어나며, 세포막에 존재하는 고친화성의 IgE 수용체(Fc□RI)를 통해서 활성화된다. IgE 수용체에 결합되어 있는 IgE 항체가 항원에 의하여 가교(bridge)를 형성하면 포스포리파아제 C, 단백질 인산화효소 C, 칼슘 이온의 작용을 거쳐서 과립에 저장되어 있던 히스타민(histamine), 콘드로이틴(chondroitin) 황산염, 헤파린(heparin), 단백질 분해효소 등이 유리됨으로써 반응 초기 단계를 매개한다. 히스타민을 포함하는 전기 화학 전달물질들은 알레르기 반응의 초기에 볼 수 있는 여러 가지 임상증상을 유발하는 원인물질들이며, 가장 많은 양을 차지하는 것은 히스타민이다. 따라서, 알레르기 반응에서 히스타민에 의한 작용이 주요하며, 그 증상으로는 혈관 확장, 부종 등이 있다.

프로스타글란딘(prostaglandin), 혈소판 활성인자(platelet-activating factor) 등도 알레르기 반응에서 주목받고 있는 화학 전달물질들이다. 화학 전달물질의 작용으로 인하여 나타나는 증상으로는 담마진, 소양증, 피부발적 등의 피부증상, 복통, 설사 등의 위장관 증상, 기관지 수축, 천명, 호흡곤란 등의 기관지천식 증상, 그리고 콧물, 재채기 등 비염 증상이 있다.

그러나, 알레르기 반응의 새로운 개념인 후기의 염증 반응은 이들 화학 전달물질의 작용만으로는 설명하기 어렵다. 특히, 혈소판 활성인자는 강력한 호산구(好酸球) 화학주성을 가지고 있어, 히스타민에 의해서 확장된 혈관을 통해서 호산구가 침윤되고 호산구로부터 유리된 독성 물질에 의하여 세포 파괴가 지속될 수 있다.

최근에 발표된 많은 병리소견에서 만성 염증성 반응이 알레르기 반응에서 공통적으로 발견되었고, 특히 6 시간 전후에 나타나는 후기 반응의 기전이 염증 반응으로 이해되고 있기 때문에, 비만세포로부터 유리되는 화학 전달물질 외에 염증성 사이토카의 일종인 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor, TNF-□)가 이러한 알레르기성 염증반응의 유도에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

그러나, 현재 예방치료를 목표로 하여 각종 항알레르기제가 개발되고 있으나, 복잡한 알레르기성 질환의 병태를 반영하여 그 생체에서의 유효율은 기대에 미치지 못한다. 아울러, 알레르기 질환을 근본적으로 치료하려면 증상 치료뿐만 아니라 알레르기성 염증 치료도 함께 이루어져야 한다.

따라서, 반응 초기의 특이적 면역반응 및 반응 후기의 염증 반응에 관여하는 화학 전달물질들에 대하여 분비 억제 효과를 가지는 항알레르기제 개발의 필요성이 대두되었다. 천연물을 이용하거나 전통적 민간 요법들을 이용하여 알레르기 질환 치료 및 예방을 위하여 다양한 방법이 시도되고 있으나, 이러한 방법들이 아직까지 충분한 효과를 거두지 못하고 있다. 따라서 보다 효과적이고, 실용적이며, 안정성이 있는 알레르기 질환 예방 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

【발명이 이루고자 하는 기술적 과제】

이에, 본 발명자들은 항 알레르기 효과를 가지는 천연물 유래의 항 알레르기제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 자죽염이 비만세포로부터 히스타민의 분비를 유의성 있게 억제하며, 이개부종반응과 수동적 피부 알레르기 반응에도 효과가 있고 알레르기성 염증 반응에 관여하는 종양괴사인자 알파의 분비에 대하여 억제효과가 있음을 규명하여 민간의료요법에서 사용되어온 자죽염의 효능이 탁월함을 과학적으로 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 즉각형 알레르기 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 나타내는 신규 의약 조성물 및 그 조성물의 신규한 용도를 제공하기 위한 것이다.

【발명의 구성】

첫째, 본 발명은 유효성분으로서 자죽염이 비만 세포를 매개로 하는 즉각형 알레르기 질환 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물이 유효한 질환은 비만 세포를 매개로 하여 발생되는 알레르기, 천식, 아토피등 다양한 알레르기성 염증 질환이다. 상기 본 발명의 조성물들은 분말 제제로 제형화되는 것이 바람직하다.

둘째, 본 발명은 자죽염을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 유효성분으로서 자죽염의 즉각형 알레르기 질환 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 자죽염(Purple bamboo salt)은 전통적 방법에 의해 죽염제조 공장에서 제조된 식용죽염으로서 9회 구운 죽염이다. 이 조성물은 민간에서 암, 염증성 질환, 바이러스성 질환, 당뇨, 순환기 장해 등의 질환에 응용되고 있다.

상기 언급한 자죽염의 농도는 반복된 실험 결과를 토대로 얻어진 것이며 그 하한치보다 낮을 경우에는 그 성분의 약리 효과가 감소하며 그 상한치보다 높을 경우에는 세포 독성을 나타낼 우려가 있다.

본 발명의 조성물은 비만 세포를 매개로 하는 즉각형 알레르기 질환 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있으며, 이러한 약리효과는 하기 실험예 1 내지 4로부터 확인된다. 본 발명에 따른 조성물은 면역 담당세포로부터 히스타민 유리를 조절하여 알레르기 반응을 억제하는 것으로 추정된다.

본 발명의 조성물은 대나무에 흰 소금을 넣고 황토로 밀봉하여 800-1500□로 9번 구운 후 완성된 죽염을 분말화 하고 그 분말을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합 조성한후, 통상적인 약제 제조방법을 이용하여 적당한 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은 효과면에서 분말이 바람직하나, 필요에 따라서는, 환제, 액제, 분무제, 캅셀제 형태로 제조할 수 있고, 필요에 따라, 사용시에 다른 제형으로 바꾸어 사용할 수도 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시 예에 의하여 보다 구체적으로 설명하지만 이들에  의해 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실험예 1: 자죽염에 의한 히스타민 방출 억제

자죽염에 의한 히스타민의 방출 억제 효과를 상기 흰쥐의 복강 비만 세포를 이  용하여 조사하였다.

복강내 비만세포는 다음과 같은 방법을 통해 분리하였다.

흰쥐 복강에 30□ 정도의 Tyrode 완충용액 B(137mM NaCl, 5.3mM 글루코스, 12mM NaHCO3, 2.7mM KCl, 0.3mM NaH2PO4)를 주입하고 복부를 90초 정도 마사지 한 후 복막을 조심스럽게 열어서 파스퇴르 파이펫으로 복강내 세포를 포함하고 있는 Tyrode 완충용액 B를 수거하였다.  이어, 상기 세포함유 용액을 150 □g로 10분 동안 원심분리하여 세포를 침전시키고 침전된 세포에 Tyrode 완충용액 B를 가하여 파이펫팅한 후 22.5% 메트리자마이드 (metrizamide) 용액위에 살짝 적층하고 400 □g에서 15분 동안 원심분리하여 침전된 세포만을 얻었다.  전기 침전된 세포에 □-MEM(minimum essential medium)/50% FBS (fetal bovine serum)를 가하고, 파이펫팅하여 톨루이딘 블루염색 방법을 통해 비만세포가 95% 이상이고, 트립판 블루염색에 의해 생존능력이 97% 이상임을 확인하고 실험에 사용하였다.

전기 정제된 비만세포에 □-MEM/50% FBS를 가하고 조심스럽게 파이펫팅한 다음, 2 □105개의 세포가 되도록 분주하였다.  세포를 안정화시키기 위하여 죽염를 처리하기 전에 37□에서 10분 동안 미리 배양하고, 죽염 수용액을 각각 0.01, 0.1, 1.0 mg/ml -증류수 농도 (증류수 1ml당 가시오갈피 유식물체 추출물 0.01, 0.1, 1 mg을 녹인것)가 되도록 가하고  37□에서 30분 동안 처리한 다음, 곧바로 '화합물 48/80'  5.0 □/□ (부피당 시약의 양)을 10분 동안 처리하였다. 반응이 종료 후 400 □g에서 원심분리하여 상층액과 세포를 분리하였다.

히스타민 정량은 OPA(□-phthaldialdehyde) spectrofluorometry 방법(Kim et al., 2000.)으로 438nm에서 측정하였으며, 히스타민 분비의 억제율은 다음과 같은 식을 사용해 계산하였다.

억제율 (%) = (약물을 부가하지 않았을 때의 히스타민의 량-약물을 부가하였을 때의 히스타민의 량)□100/약물을 부가하지 않았을 때의 히스타민의 량

그 결과, '화합물 48/80'에 의하여 유도된 복강 비만세포로부터 히스타민의 분비가 자죽염에 의해 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다(도 1).

Fig.1. Effects of cell cultured purple bamboo salt on compound 48/80-induced histamine release from RPMCs. RPMCs (2 □ 105 cells/ml) were preincubated with drug at 37□C for 10 min prior to incubation with compound 48/80. Each datum is presented as the S.E.M. of three independent experiments. *P<0.05: significantly different from the control value.

실험예 2: 자죽염에 의한 이개 부종 반응의 억제

이개 부종 반응에 대한 자죽염의 효과를 조사하였다.

Compound 48/80을 saline에 녹인 후 28 게이지의 미세실험동물로서 4□6 주령의 체중 25□35 g인 ICR계 흰쥐를 실험 군별로 4 마리씩 사용하여 반복 실험하였다. 먼저 충분히 섭식시킨 후 24 시간 경과한 상기 흰쥐를 대상으로 하였다. 상기 흰쥐는 대한 동물센터로부터 입수하였다. 자죽염을 농도별로 (0.01, 0.1 및 1 g/□) 경구 투여한 후 1 시간 동안 방치하였다.  그 후 compound 48/80 (20 g/□)을 미세 주사기를 사용하여 쥐 귀 피하 내부에 주입하고 40 분 후에 이개 부종반응이 일어난 부위의 귀 두께를 측정하였다.

그 결과 compound 48/80에 의해 유도된 이개 부종 반응이 자죽염에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. (표 1)

표 1. Effect of Purple bamboo salt on compound 48/80-induced ear swelling response in micea

Purple bamboo salt concentration (g/kg)b	Thickness (mm)	Inhibition (%)c
None	-	-
0.01	0.170□0.008*	29.96
0.1	0.957□0.003*	60.73
1	0.120□0.002*	51.32

a20 □l of compound 48/80 (100 g/site) were applied intradermally.

bThe mice were orally administered with the indicated concentration of purple bamboo salt for 1 h prior to the compound 48/80 application.

cEach datum represents the mean □ S.E.M of three independent                 experiments.

*P<0.05: significantly different from the saline value.

실험예 3: 자죽염의 수동적 피부 알레르기 반응에 대한 효과

수동적 피부 알레르기 반응에 대한 자죽염의 효과를 조사하였다.

먼저 다음과 같은 방식으로 인위적인 피부 알레르기(passive cutaneous anaphylaxis, PCA) 반응을 일으켰다.

anti-DNP(dinitrophenyl) IgE를 상기 흰쥐의 피내(피하) 주입하여 피부를 감작시킨 다음, 48 시간 후에 항원 DNP-HSA(dinitrophenyl-human serum albumin)를 꼬리에 정맥 주사하여 IgE 의존성 피부 반응을 유발하였다. 이때 DNP-HSA는 PBS(phosphate buffered saline)으로 희석하였다.  흰쥐의 등에 anti-DNP IgE 100ng 주입하고 48 시간 경과 후 4% 에반스 블루(evans blue)와 DNP-HSA를 1:1로 혼합한 용액을 쥐의 꼬리정맥에 주사하였다.  항원(DNP-HSA)을 투여하기 1 시간 전에 자죽염 1 g-추출물/Kg-체중의 양을 흰쥐에 구강 투여하였다.

흰쥐를 치사시킨 후 반응이 일어난 부위를 절단하여 0.1N 수산화칼륨 500□를 첨가한 다음, 아세톤과 인산(5:13, w:w) 혼합용액을 4.5□씩 가하여 색소를 추출하였다.  620nm에서 추출물의 흡광도는 측정하였으며, 에반스 블루 표준 곡선을 이용하여 색소량을 측정하였다.

그 결과, 자죽염 0.01, 0.1, 1.0g/kg 농도에서 농도 의존적으로 수동적 피부 알레르기 반응을 억제하였다. 이러한 결과는 자죽염의 경구투여를 통해 국소, 즉 피부 알레르기 반응을 현저하게 억제할 수 있음을 의미한다.

표 2. Effect of Purple bamboo salt on 48 h passive cutaneous anaphylaxis in mice

Purple bamboo salt addition (g/kg)a	Amount of dye (□g/site)b	Inhibition (%)
None	0.7598□0.11256	-
0.01	0.7049□0.08565	7.8
0.1	0.5749□0.08565	24.3
1	0.3650□0.01383*	51.9

aPurple bamboo salt dissolved with distilled water was orally administered to mice 1 h before the challenge.

bEach value indicates mean□SEM

*P<0.05: significantly different from the saline value

실험예 4: 자죽염의 종양괴사인자 억제효과

자죽염이 IgE-항원의 자극에 의해 생성되는 종양괴사인자 알파의 분비를 조절하는지 여부를 조사하였다.

세포(비만세포주 RBL-2H3, Kim et al., 2000)를 항원으로 자극하기 전에 배양된 죽염을 30분 동안 다양한 농도로 전처리 하였다.  배양(5% CO2, 37□에서 4시간 배양)된 상층액 중의 종양괴사인자 알파의 단백질 수준을 조사하기 위하여, 96-웰 플레이트에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 중복 실험하였다.

사이토카인에 대한 단일클론 항체인 anti-murine 종양괴사인자 알파 (1□/□)를 PBS(pH 7.4)로 희석하여, 96-웰 플레이트에 100□씩 각각 코팅한 다음, 4□에서 12시간 동안 방치하였다.  전기 플레이트를 0.05% Tween이 포함된 PBS로 세척한 다음, 1% BSA, 5% 슈크로스, 0.05% NaN3를 함유한 PBS로 1 시간 동안 차단시켰다.  수차례 세척한 다음, 원심분리하여 얻은 상층액과 표준 사이토카인을 첨가한 후 37□에서 2 시간 동안 방치시켰다.  이어, 각 웰을 다시 세척하고 2차 항체 종양괴사인자 알파 (0.2□/□)를 첨가하여 다시 37□에서 2시간 동안 방치시킨다.  웰을 세척한 다음, 토끼 IgG에 연결된 알칼리성 탈인산화 효소와 아비딘(avidine) 이 연결된 과산화효소를 첨가하고 37□에서 20분 동안 방치시켰다.  웰을 다시 세척한 다음, PNPP(p-Nitrophenyl phosphate)와 ABTS(2, 2□-AZINO-bis(3-ethylbenzthiazoline -6-6 sulfonic acid) 기질을 첨가하고, 발색반응을 ELISA 판독기를 사용하여 405nm에서 측정하였다.

실험 결과 표 3에서 볼 수 있듯이, 자죽염 0.1 mg/ml 에서 종양괴사 인자 알파의 분비량을 현저하게 억제하는 것을 알 수 있었다.

표 3. Effect of purple bamboo salt on IgE-stimulated TNF-□ secretion from RBL-2H3.

Purple bamboo salt addition (mg/ml)a	TNF-□ secretion (ng/ml)	Inhibition (%)
None	0.172□0.013	-
0.01	0.238□ 0.004
0.1	0.114□0.008*	33.7*
1	0.231□0.007

Effect of purple bamboo salt on IgE-stimulated TNF-□ secretion from RBL-2H3. TNF-□ levels in supernatant were measured using ELISA method. Each datum represents the mean□S.E.M. of 3 independent experiments. *P<0.05 : significantly different from the control value.

【특허청구범위】

【청구항 1】

유효성분으로서 자죽염의 즉각형 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.

【청구항 2】

제1항에 있어서, 알레르기 질환이 염증성 알레르기 질환과 아토피인 조성물.

【청구항 3】

제1항 또는 제3항에 있어서, 산제로 제형화되는 조성물

【청구항 4】

자죽염을 분말화하고, 그 분말을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 제1항에 따른 조성물을 제조하는 방법.