죽염의 청각유모세포 보호효과

【요약서】

【요약】

청각기능의 장애는 항암제, 소음, 및 스트레스에 의해서 생성된 활성산소종에 (reactive oxygen species) 의한 청각유모세포 (cochlear hair cell) 고사에서 비롯된다. 본 발명은 카스페이즈 (caspase) 활성화 억제, 사이토크롬-C (cytochrome-c) 분비 억제, 세포고사유도인자 (apoptosis-inducing factor)의 핵 내 이동 억제, 및 활성산소종 생성 억제를 통해 청각유모세포의 고사를 억제함을 알 수 있었다. 본 발명품은 청각유모세포의 고사를 억제함으로써 시스플라틴에 의한 청각기능 장애를 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품으로 사용할 수 있다.

【대표도】

도 1

【색인어】

청각기능 장애, 항암제, 소음, 죽염, 청각유모세포, 세포고사, 의약품, 건강기능식품

【명세서】

【발명의 명칭】

청각유모세포 보호활성을 갖는 죽염을 포함하는 청각기능 장애 예방 및 치료용 약학 조성물

【도면의 간단한 설명】

도 1A는 시스플라틴에 의한 세포고사에 있어서 죽염의 세포생존효과를 MTT-assay를 통해 나타낸 그래프이며, 1B는 시스플라틴에 의한 DNA분절에 있어서 죽염의 효과를 나타낸 그래프이며, 1C는 LDH 분비량을 나타낸 그래프이다.

도 2는 시스플라틴에 의한 세포고사 시 세포의 형태학적 모양을 현미경으로 관찰한 도면이다.

도 3은 아넥신-V결합을 flow cytometry를 이용하여 분석한 도면이다

도 4는 시스플라틴에 의한 카스페이즈-3, -8,과 -9 활성에 있어서 죽염의 효과를 카스페이즈 정량을 통해 나타낸 그래프이다.

도 5는 시스플라틴에 의한 사이토크롬-C (A)와 apoptosis-inducing factor (AIF) (B)의 발현정도를 웨스턴 블랏을 통해 나타낸 도면이다.

도 6은 시스플라틴에 의한 활성산소종 생성에 있어서 죽염의 효과를 나타낸 그래프이다.

【발명의 상세한 설명】

【발명의 목적】

【발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술】

본 발명은 청각유모세포 보호활성이 있는 죽염을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 청각유모세포의 고사에 의해 발생되는 청각 기능 장애 등을 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능 식품에 관한 것이다.

시스플라틴은 매우 효과적이며 가장 많이 사용되는 항암제 (anti-cancer agent) 이지만 (Trimmer and Essigmann. Essays Biochem. 1999) 부작용으로 내이의 신경독성물질로도 알려져 있다. 시스플라틴은 생체내□외에서 청각세포의 세포고사를 유도한다 (Cheng et al., Brain Res. 1999; Alam et al., Hear. Res. 2000). 시스플라틴에 의한 세포독성은 여러 가지 과정을 통해서 유도되는데 가장 잘 알려진 반응 기작은 세포주기를 차단함으로써 DNA adduct를 형성하는 것이고, 다른 기작은 활성산소생성을 통한 것이다 (Jamieson and Lippard. Chem. Rev. 1999; Masuda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994). 시스플라틴 세포독성 기전은 카스페이즈-3, 8과 -9활성, Bid truncation, 사이토크롬 C 분비, 마이토젠-활성 단백질 카이네이즈 (mitogen-activated protein kinase)를 통해 일어난다고 보고되었다 (Wang et al., Cancer Res. 2004).

미토콘드리아 내막 플라보단백질, 세포고사-유도인자 (apoptosis-inducing factor, AIF)는 세포고사 과정에서 카스페이즈 비의존적으로 미토콘드리아로부터 핵으로 이동한다. 재조합된 AIF를 세포내에 주입한 결과 DNA 분절과 크로마틴 응결을 일으킨다는 것이 보고되었다 (Susin et al., Nature 1999; Daugas et al., FASEB J. 2000).

소음, 저산소증, 또는 시스플라틴에 의한 포유류 와우기관의 유모세포는 재생이 되지 않는다 (Cheng et al., Brain Res. 1999; Pirvola et al., J. Neurosci. 2000). 시스플라틴은 소리의 증폭과 주파수 결정에 관여하는 와우기관의 외유모세포에 일차적인 손상을 준다. 또한, 과량의 시스플라틴 사용은 외유모세포근처의 청각신경세포 (auditory neuron), stria vascularis, 지지세포 (supporting cells)에 손상을 준다 (Cardinaal et al., Hear. Res. 2000). 그러므로 이러한 기작의 선택적인 억제는 시스플라틴에 의한 내이 신경독소를 최소화하는 방법을 제공할 수 있다.

죽염은 일반적으로 사용되고 있는 일반소금이나 대나무 또는 송진 등을 이용하여 전통적인 제조법에 따라 제조하는 과정에 있어, 좀더 특별한 가공법을 통해 만들어지는 소금이다. 죽염은 다양한 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 바탕으로 민간에서 널리 이용되고 있으며, 특히, 치주염을 포함한 구강관련 질환과 위장병, 당뇨, 심혈관 질환, 암, 염증 관련 질환에 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 죽염은 특히 천연 나트륨과 칼륨, 칼슘 뿐만아니라 염소, 마그네슘 등의 풍부한 천연 미네랄을 함유하고 있어, 인체의 미량원소 균형에도 유용한 물질로 알려져 있으며, 죽염을 다양한 형태로 복용하기 위한 식․의약품으로써의 형태 개발에 많은 시도가 이루어지고 있는 상황이다.

한국등록특허 출원번호0037722호에서는 죽염을 유효성분으로 함유하는 혈압저하 효과 제제로써 등록되어 있고, 한국등록특허 출원번호 0043503호에서는 죽염을 함유하는 구취제거용 조성물에 관해 개시하고 있다.그러나, 현재까지 죽염의 시스플라틴에 의한 청각유모세포보호 효과기전에 의한 질환의 예방 및 치료 효능에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 연구의 목적은 시스플라틴의한 청각유모세포 손실에 있어서 죽염의 효과를 규명하였다.

연구 결과, 본 발명에 따른 죽염은 카스페이즈 활성 억제를 비롯하여 사이토크롬 C 분비 억제 및 AIF의 핵 내로의 이동을 차단함으로써 시스플라틴에 의한 세포고사를 억제하였다. 또한 활성산소종 정량실험에서 죽염은 시스플라틴에 의해 생성된 활성산소종 생성도 억제함을 알 수 있었다. 결과적으로 시스플라틴에 의한 청각기능장애에 대한 치료효과와 치료기전을 약리학적으로 관찰하여 죽염이 청각유모세포 보호활성을 갖는다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

【발명이 이루고자 하는 기술적 과제】

본 발명은 청각유모세포 보호활성을 갖는 죽염이 청각기능 장애 예방 및 치료에 효과적인 약학조성물 또는 건강기능 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

【발명의 구성】

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 청각유모세포 보호활성을 갖는 죽염을 유효성분으로 포함하여 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 청각기능 장애 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에서 죽염(bamboo salt)이란 기본적으로 전통적인 제조방법을 따르면서, 일반천해 소금(bay salt)이나 대나무(bamboo), 송진(pine resin) 등을 원료로 1800-3000 °C 의 초고온에서 9번의 특정한 가공과정을 거친 것을 일컫는다. 본 발명에 따른 죽염 원말은 정제화하기 이전의 100% 죽염 분말을 미쇄 분말화한 것이 바람직하다. 이 때, 유효 성분이 파괴되지 않도록 분쇄하여 미세분말화하며, 바람직하게는 초음속 제트 분쇄기를 사용한다. 본 발명에 따른 죽염 추출물은 죽염 분말에 약 10배의 정제수를 가하여, 바람직하게는 4℃의 온도에서, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 추출하여, 동결 건조 시킨 후 distilled water에 용해시켜 제조한다.  이 발명에 의한 생체 외 실험에서 청각유모세포의 고사를 보호하여 여러 요인에 의한 청각유모세포 손상을 현저히 예방 및 치료 할 수 있음을 확인하였다.

상기 청각기능 장애는 청각유모세포 고사에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 청각유모세포 손실에 의한 질환으로, 이명, 난청, 어지럼증 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 기타 식품의 주, 부원료 및 식품첨가제로서 사용이 가능하다.

또한, 본 발명은 청각기능 장애 예방 및 개선 효과를 나타내는 상기 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 청각기능 장애 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 식품에는 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다.

이하, 본 발명을 하기 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 죽염의 청각유모세포 보호 작용

1-1. 세포 생존율 측정 (Viability Test)

세포고사는 세포생존율로 측정하였으며 그 세포생존율 측정을 위한 MTT assay는 다음과 같이 시행하였다. 먼저, 실험에 사용할 세포, HEI-OC1을 세포 배양판에 1×105 cells/㎖씩 분주하여 3시간 안정화시키고, 안정화된 세포에 본 발명의 죽염을 농도별로 처리하여 일정시간 후에 시스플라틴을 처리한 다음 MTT (0.5 ㎎/㎖)를 3시간 반응시켰다. 살아있는 세포에 의해 MTT로부터 생성된 보라색 불용성 formazan은 DMSO로 용해하여 540 ㎚ 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 측정한 formazan 생성 정도를 흡광도로 표시하였다. 도 1A에서, 죽염과 일반소금은 시스플라틴에 의한 세포고사를 억제함으로써 세포 보호 작용이 있음을 알 수 있었다. 그러나 죽염이 일반소금에 비해 보호효과가 더 높은 것을 확인하였다 (죽염 약 120%, 일반소금 약 60%). 또한 청각유모세포 보호효과가 있다고 알려진, 카나비노이드 수용체 아고니스트인 JWH-015 (약 80%)보다 그 효과가 더 높은 것을 확인하였다.

1-2. DNA 분절에 미치는 영향

DNA 분절 (fragmentation)은 Cell death detection ELISA plus kit (Roche molecular biochemicals, 독일)를 사용하여 분석하였다. 먼저, 실험에 사용할 세포, HEI-OC1을 세포 배양판에 1×104 cells/㎖씩 분주하여 3시간 안정화시키고, 안정화된 세포에 본 발명의 죽염을 농도별로 처리하여 일정시간 후에 시스플라틴을 48시간 처리하였다. 세포 파쇄용액으로 세포를 파쇄한 후 핵 추출액을 얻었다. 방법은 제조자의 표준 방법을 따랐다. 마지막으로 405 nm와 490 nm 파장 (참고 파장)에서 흡광도를 측정한 결과를 도 1B에 나타내었다. 도 1B에서와 같이 죽염이 시스플라틴에 이한 DNA 분절을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

1-3. LDH 분비에 미치는 영향

죽염이 세포 고사를 억제하는지 알아보기 위해, HEI-OC1에 죽염을 전처리 한 후 시스플라틴을 처리해 세포 배양액에서 락테이트 디하이드로게네이즈(lactate dehydrogenase, 이하 'LDH'라 칭함)의 수준을 정량하여 세포고사를 분석하였다.

그 결과, 시스플라틴에 의해 LDH 분비가 증가된 것을 세포 배양액 정량을 통해 알 수 있었으며, 죽염에 의해 LDH 분비가 억제됨을 알 수 있었다 (도 1C).

1-4. 세포의 형태학적 모양에 미치는 영향

세포고사의 형태학적 모양에 있어서 죽염이 영향을 미치는지 알아보기 위해, HEI-OC1에 죽염과 일반소금을 전처리 한 후 시스플라틴을 처리해 세포모양을 광학현미경으로 관찰하였다. 도 2에서 보이는바와 같이 죽염과 일반소금 모두 세포 원래 모습을 보호함을 알 수 있었다.

1-5. 아넥신-V결합에 미치는 영향

세포고사(apoptosis)는 아넥신-V-FITC 염색 kit를 사용하여 측정하였다. 실험에 사용할 세포, HEI-OC1을 세포 배양판에 1×106 cells/㎖씩 분주하여 3시간 안정화시키고, 안정화된 세포에 본 발명의 죽염을 농도별로 처리하여 일정시간 후에 시스플라틴을 24시간 처리하였다. 부착된 세포를 트립신으로 땐 후 침전된 세포를 완충용액으로 씻은 후 완충용액으로 현탁시켰으며 현탁된 세포 100 ㎕를 아넥신 V-FITC (5 ㎕)와 100 ㎍/㎖ PI로 염색하였다. 염색된 세포에 400 ㎕ 아넥신-결합용액을 첨가 한 후 flow cytometry로 분석하였다. 도 3에서 나타난 것처럼 죽염은 시스플라틴에 의한 아넥신-V결합을 억제한 것을 알 수 있었다.

실험예 2: 죽염의 청각유모세포고사 보호작용 기전

2-1. 카스페이즈의 활성에 미치는 영향

카스페이즈 류(Caspase family)는 염증반응 및 세포고사 유도에 핵심적인 역할을 하는 효소로서, 현재 14 종류의 효소가 알려져 있다. 이중 카스페이즈-3는 카스페이즈 캐스케이드의 하방에 위치하여 상방에 위치한 카스페이즈-8과 카스페이즈-9의 활성신호와 합류하는 효소로서 손상된 DNA복구에 관련된 단백질인 PARP를 절단하여 세포고사를 유도한다. 따라서 청각 유모세포에 죽염을 처리하고 시스플라틴 처리한 후 카스페이즈-3, -8 및 -9의 활성을 각각 측정하였다. 실험조건의 세포를 4℃에서 세포 파쇄용액(1% Triton X-100, 0.32 M sucrose, 5 mM EDTA, 1mM PMSF, 1 ㎍/㎖ leupeptin, 2 mM DTT, 10mM Tris/HCI, pH 8.0)으로 파쇄하여 14,000 rpm으로 15분간 원심분리하고, 이때 얻어진 상층액은 540 nm에서 정량하였다. 정량하여 얻어진 100 ㎍의 세포 파쇄액은 caspase assay buffer (100 mM HEPES, 10% sucrose, 0.1% chaps, 1 mM PMSF, 1 ㎍/㎖ aprotinin, 1 ㎍/㎖ leupeptin, 2 mM DTT, pH 7.5)에 희석되어 기질과 37℃에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader로 405 nm에서 caspase activity (caspase-3: DEVD-pNA, caspase-8: IETD-pNA, caspase-9: LEHD-pNA)를 측정하였다. 도 4에서는 HEI-OC1세포에 죽염을 전처리한 후 시스플라틴을 처리하여 카스페이즈-3, -8 및 -9의 활성을 각각 측정한 그래프이다. 도 4의 그래프를 참조하면,  카스페이즈-3, -8 과 -9이 죽염에 의해 유의하게 억제됨을 알 수 있다. 그러나 일반소금은 카스페이즈-3와 -8만 억제함을 알수 있었으며 그 억제율도 죽염이 더 높음을 알 수 있었다.

2-2. 핵 및 미토콘드리아에 미치는 영향

사이토크롬 C는 세포고사이 일어나게 되면 미토콘드리아로부터 세포질로 분비되며, AIF는 미토콘드리아로부터 나와서 핵으로 이동하게 된다. 핵과 세포질 분획을 이용하여 세포질 내 사이토크롬 C 분비와 핵 내 apoptosis-inducing factor (AIF) 이동량을 웨스턴 블랏으로 분석하여 조사한 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과 시스플라틴에 의해 세포질로 사이토크롬 C분비가 유도된 것을 알 수 있었으며 이러한 분비는 죽염에 의해 억제됨을 알 수 있었다 (도 5A). 또한 죽염은 시스플라틴에 의한 AIF의 핵 내로의 이동을 억제함을 알 수 있었다 (도 5B). 그러나 일반소금은 사이토크롬 C분비와 AIF의 핵 내로의 이동을 억제하지 못했다.

2-3. 활성산소생성 억제 작용

죽염이 활성산소종 (ROS) 생성에 미치는 영향을 형광을 생성하는 탐색물질(fluorogenic probe)인 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 이용하여 조사하였다. DCFH-DA는 green 형광을 내는 fluorescein을 화학적으로 환원하여 무색, 무형광인 leuco dye로 변환한 것으로, 활성산소종에 의하여 산화되어 원래 물질인 fluorescein으로 돌아갈 수 있다. 따라서 DCFH-DA는 세포와 조직의 산화활성을 검색하기 위한 형광생성물질로 이용될 수 있다. DCFH-DA는 세포막을 통과하여 세포내로 들어갈 수 있으며 esterase에 의하여 acetyl 기가 가수분해되어 형광산물인 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF)를 형성한다. 따라서 DCF의 세포내 축적은 산화환원 활성물질 (redox-active substances)의 생성을 의미한다. 죽염이 활성산소종 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 죽염을 2시간 전처리하고, 시스플라틴 처리 24시간 후에 DCFH-DA용액을 처리한 다음 Cytofluor 2350 Plate Reader (Millipore Bedford, MA, USA.)를 사용하여 485 nm excitation과 538 nm emission에서 측정했다. 도 6의 그래프를 참조하면, 죽염이 활성산소종의 생성을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.  이 실험결과는 죽염이 활성산소종의 생성을 억제하는 효능이 있음을 의미한다.

【발명의 효과】

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 죽염은 시스플라틴에 의해 발생되는 청각유모세포고사에 대한 보호 작용 및 저해 효과가 탁월할 뿐만 아니라 인체에 무해하여 청각유모세포의 고사에 의해 발생되는 청력기능 장애 예방 및 치료를 위한 용도로 사용가능하다.

【특허청구범위】

【청구항 1】

청각유모세포 보호활성을 갖는 죽염을 유효성분으로 포함하며 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 이명, 난청, 어지럼증의 예방 및 치료용 약학조성물.

【청구항 2】

청각유모세포 보호활성을 갖는 죽염을 유효성분으로 포함하며 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 이명, 난청, 어지럼증의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품.

【청구항 3】

제2항에 있어서, 정제, 환제, 캡슐제 또는 액제인 건강기능식품.

【도면】

【도면 1】

【도면 2】

【도면 3】

【도면 4】

【도면 5】

【도면 6】